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本制品是基于T7 RNA聚合酶体外转录原理的标记试剂盒，得到的DIG标记的RNA探针可以用于分子杂交等实验。

利用含有T7启动子的模版DNA，以含DIG-UTP的NTP为底物，从T7启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的、DIG标记的RNA探针。

• 即开即用，用户只需提供含T7启动子的DNA模板即可以进行体外转录标记实验，不需要单独准备每一个成份。
  
• 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
  
• 模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
  
• 可以合成的DIG标记的RNA的最佳长度在20nt到2000nt之间。
  
• 产品配方经过精心优化，每μg DNA模版可以合成2μg DIG标记的RNA。
  
• 本试剂盒足够20次20μL体系的体外转录实验，并且只能用于科研。

• 是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
  
• 是需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列(5'TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3')加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子下游。
  
• 是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3'突出。如果是3'突出(比如选择了Pst I来线性化质粒)，则最好用T4 DNA聚合酶修平。
  
• 是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收的方法回收质粒DNA，并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。如果有RNase污染，则必须使用酚-氯仿抽提法反复去除残留的RNase，然后再乙醇沉淀质粒DNA。

• 如果有N个样品，强烈建议做一个阴性对照，故共设置N+1个反应，这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板DNA，哪个条带是扩增得到的标记RNA。在N+1个RNase-free的塑料离心管中，在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分(T7转录标记预配液容易产生结晶沉淀，一定要握在手中直到结晶彻底溶解并摇匀后方可使用)：
  

  成分	N个样品管	阴性对照管
  DNA模板	50ng左右的PCR片段 或1μg左右的线状质粒	不加
  2×T7转录标记预配液 (含DIG-UTP)	各10μL	10μL
  T7 RNA聚合酶-RI混合液	各1μL	1μL
  RNase-free水到	20μL	20μL

  • 此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。本制品的T7转录标记预配液已经含有NTP和DIG-UTP。
• 37℃保温1～2小时，再42℃保温1～2小时。
  
• 加入2μL自备的500mM的EDTA溶液灭活T7 RNA聚合酶。
  
• 取1～3μL电泳，此时最好用DNA模板做电泳对照。电泳时比阴性对照多出的条带就是扩增得到的标记RNA(由于合成的标记RNA长度不均匀，即使长度均匀，但由于自生形成发夹结构，泳动速度也不一致，所以电泳所得标记RNA条带一般都不是清晰，而是比较弥散的电泳条带。但由于标记RNA是单链，分子量比同样长度的DNA小一倍，因此标记RNA一般比其双链DNA模板电泳速度更快。
  
• 定量，可以用自备的单链RNA定量试剂盒检测浓度。不推荐使用电泳定量。使用本试剂盒时1μg DNA模板一般可以合成2μg的标记RNA。
  
• 得到的标记RNA可以放-80℃保存也可以直接用于分子杂交。杂交时双链的模板DNA并不会干扰杂交，故可以不去除。